Súprava minipreparácie endo-free plazmidu

Súprava používa špeciálne formulovaný tlmivý roztok v kombinácii s technológiou reverzibilnej adsorpcie nukleovej kyseliny pomocou silikagélovej membrány, dokáže takmer úplne odstrániť endotoxín, proteín a iné nečistoty z 1~5 ml kultúry Escherichia coli a výťažok plazmidovej DNA je 5 ~20 ug. Extrahovaný plazmid môže byť použitý v biologických experimentoch, ako je štiepenie reštrikčnými enzýmami, ligačná reakcia, PCR amplifikácia, sekvenovanie, transformácia, transfekcia atď.

RNáza A sa dodáva s mokrým ľadom a skladuje sa pri -20 stupňoch . Ostatné činidlá sa dodávajú a skladujú pri teplote miestnosti; platnosť 12 mesiacov.

1. Vyžaduje sa bezvodý etanol a 1,5 ml centrifugačná skúmavka bez obsahu nukleázy, ale nie sú súčasťou tejto súpravy.

2. Pripravte 42-stupňový vodný kúpeľ alebo ohrievací modul.

3. Pred použitím pridajte všetku RNázu A dodanú v súprave do tlmivého roztoku P1 a môžete ho skladovať pri teplote 4 stupňov po dobu 6 mesiacov.

4. Pred použitím pridajte 60 ml bezvodého etanolu do pufra PW.

5. Ak sa tlmivý roztok P2 vyzráža, zohrejte ho vo vodnom kúpeli na 37 stupňov na niekoľko minút, aby sa obnovilo vyčírenie. Po použití pufra P2 treba veko ihneď zatvoriť, aby sa zabránilo dlhodobému kontaktu so vzduchom.

6. Pred použitím ochlaďte pufer P3 na 4 stupne.

1. Vyváženie kolóny: Pridajte 500 μl pufra BL do HiBind DNA Mini Column (HiBind DNA Mini Column sa vloží do odberovej skúmavky vopred), centrifuguje pri 12, 000 otáčkach za minútu 1 minútu pri izbovej teplote, filtrát zlikviduje a vložte HiBind DNA kolónu späť do odberovej skúmavky (spracovanú kolónu je najlepšie použiť ihneď).

2. Odoberte bakteriálnu kultúru z 1~5 ml čerstvej bakteriálnej tekutiny centrifugáciou pri 12,000 otáčkach za minútu počas 1 minúty pri izbovej teplote (odstráňte čo najviac supernatantu).

3. Pridajte 250 μl tlmivého roztoku P1 (skontrolujte, či sa má alebo nemá pridať RNáza A ako prvé), pomocou pipety alebo vortexového oscilátora dôkladne suspendujte baktérie (nezabudnite baktérie dôkladne rozptýliť, inak to ovplyvní lýzu, čo vedie k nízka kvalita a čistota extrahovaného plazmidu).

4. Okamžite pridajte 250 μl pufra P2 a jemne ho otočte hore dnom na 8 až 10-krát, aby sa baktérie úplne lyzovali (tento krok by sa nemal násilne pretrepávať a mal by sa vykonať do 5 minút). V tomto bode by sa mal roztok stať čírym a lepkavým, ak nie je číry, je možné, že je tam príliš veľa baktérií a lýza nie je úplná, a treba zvážiť zníženie množstva baktérií.

5. Pridajte 250 μl tlmivého roztoku P3 (vopred ochlaďte), okamžite a jemne hore dnom 10 až 12-krát, roztok vyzerá ako kompaktný aglomerát, centrifugujte pri 12, 000 otáčkach za minútu 10 minút pri izbovej teplote, preneste supernatant do novej 1,5 ml centrifugačnej skúmavky.

6. Pridajte 75 μl tlmivého roztoku ER, po premiešaní hore nohami položte na 10 minút (premiešajte hore nohami 3~5 krát počas periódy), roztok je priehľadný modrý.

7. Inkubujte pri 42 stupňoch počas 5 minút, roztok obnoví zákal. Centrifugujte pri 12,000 otáčkach za minútu počas 10 minút pri izbovej teplote, roztok sa rozdelí na hornú a spodnú vrstvu, horná vrstva je číra vodná fáza a spodná vrstva je modrá. Opatrne zachyťte hornú vodnú fázu do novej 1,5 ml centrifugačnej skúmavky bez obsahu nukleázy.

8. Pridajte bezvodý etanol 0,5-násobok objemu vyššie uvedeného roztoku, premiešajte hore dnom a preneste do HiBind DNA Mini Column (vždy nie viac ako 700 μl). Centrifugujte pri 12,000 otáčkach za minútu 1 minútu pri izbovej teplote, filtrát vyhoďte do zbernej skúmavky. Vložte HiBind DNA Mini Column späť do odberovej skúmavky (roztok môže prejsť cez kolónu mnohokrát).

9. Pridajte 600 μl pufra ED do mini kolóny HiBind DNA, centrifugujte pri 12, 000 otáčkach za minútu počas 1 minúty pri izbovej teplote, filtrát zlikvidujte v odberovej skúmavke. Vložte HiBind DNA Mini Column späť do zbernej skúmavky.

10. Pridajte 600 μl pufra PW do HiBind DNA Mini Column, centrifugujte pri 12, 000 otáčkach za minútu počas 1 minúty pri izbovej teplote, filtrát zlikvidujte v odberovej skúmavke. Vložte HiBind Mini DNA kolónu späť do zbernej skúmavky.

11. Opakujte krok 10.

12. Centrifugujte pri 12, 000 otáčkach za minútu počas 2 minút pri izbovej teplote, umiestnite HiBind DNA Mini kolónu do novej 1,5 ml centrifugačnej skúmavky bez obsahu nukleázy. Otvorte veko a nechajte 5 minút pri izbovej teplote, aby sa etanol dôkladne odparil.

13. Do stredu membrány HiBind DNA Mini Column pridajte 50 μl tlmivého roztoku TE alebo vody bez obsahu endo a umiestnite ho pri izbovej teplote na 2 minúty. Centrifugujte pri 12,000 otáčkach za minútu 2 minúty. Ak potrebujete zvýšiť účinnosť získania plazmidov, získaný roztok je možné znova pridať do HiBind DNA Mini Column, umiestniť pri izbovej teplote na 2 minúty a centrifugovať pri 12,000 otáčkach za minútu počas 2 minút.

14. Získaná plazmidová DNA môže byť dlho konzervovaná pri -20 stupni.

1. Pred použitím si pozorne prečítajte návod na použitie.

2. Keď je počet kópií extrahovaného plazmidu nízky alebo plazmidový fragment je väčší ako 10 kb, množstvo zhromaždených baktérií by sa malo zvýšiť a dávka pufra P1, pufra P2 a pufra P3 by sa mala zvýšiť rovnakým pomerom.

3. Etanol by sa mal pred elúciou plazmidu úplne odpariť, aby sa predišlo vplyvu zvyškového etanolu na následné experimenty.

4. Pufer TE sa môže predhriať na 60~65 stupňov a čas inkubácie elúcie sa môže predĺžiť, aby sa zlepšila účinnosť elúcie.

5. Pre vašu bezpečnosť a zdravie noste laboratórny plášť a jednorazové rukavice.

Len na výskumné účely!

Populárne Tagy: miniprep súprava na plazmid bez endoplazmidu, výrobcovia, dodávatelia, továreň v Číne na minipreparáciu bez endoplazmidu