Záver najskôr:
Všetky štyri techniky-PCR, QPCR, RT-PCR a RT-QPCR-sú založené na polymerázovej reťazovej reakcii (PCR), primárne sa líšia v ich aplikačných poliach a detekčných cieľoch.
- PCR sa používa hlavne na amplifikáciu a detekciu sekvencií DNA.
- QPCR umožňuje kvantitatívnu detekciu obsahu DNA alebo cDNA v reálnom čase.
- RT-PCR sa primárne používa na amplifikáciu a detekciu molekúl RNA.
- RT-QPCR kombinuje techniky RT-PCR a QPCR na kvantitatívne analyzovanie molekúl RNA.
▆ I. Štandardný PCR
Štandardná PCR, známa tiež ako PCR prvej generácie, používa dvojvláknovú DNA ako templát a DNTP ako substrát na špecifickú amplifikáciu dvojvláknovej DNA. Elektroforéza agarózového gélu sa potom používa na kvalitatívnu analýzu produktov.
Proces PCR sa môže zhruba rozdeliť do troch základných krokov: denaturácia s vysokou teplotou (okolo 95 stupňov), žíhanie s nízkou teplotou (medzi 55 a 60 stupňami) a mierne teplotné predĺženie (približne 72 stupňov, optimálna reakčná teplota pre DNA polymerázu).
Po niekoľkých cykloch denaturácie, žíhania a predĺženia môže byť cieľový gén amplifikovaný milióny krát. Gélová elektroforéza sa môže použiť na detekciu amplifikovanej DNA (oddeľujúca DNA na základe jej molekulovej hmotnosti na identifikáciu a čistenie).
▆ II. Kvantitatívne PCR v reálnom čase (qPCR)
Kvantitatívny PCR v reálnom čase, PCR druhej generácie, zhromažďuje fluorescenčné signály v reálnom čase z cieľových génov značených fluorescenčne počas predlžovacej fázy procesu amplifikácie PCR. Číslo kópií alebo úroveň expresie cieľového génu sa určuje prostredníctvom vzťahu medzi tromi parametrami: fluorescenčný signál, hodnota CT a počiatočná koncentrácia cieľového génu. Keďže však výsledky absolútnej kvantitatívnej analýzy závisia od hodnôt CT a štandardných kriviek, tzv. „Kvantifikácia“ je v istom zmysle relatívna. Okrem toho je jeho citlivosť, presnosť a rozlíšenie detekcie obmedzené za podmienok jemných rozdielov v koncentráciách templátu génov s nízkym počtom kópií. Dve bežne používané metódy fluorescencie v QPCR sú Taqman sonda a SYBR Green.
▆ III. Reverzná transkripcia PCR (RT-PCR)
Reverzná transkripcia PCR (RT-PCR) zahŕňa reverzný transkribujúci RNA vlákno do komplementárnej DNA (s použitím RNA-dependentnej DNA polymerázy alebo reverznej transkriptázy), ktorá sa potom používa ako templát na amplifikáciu DNA prostredníctvom PCR (s použitím deoxynukleotidových primerov a DNA-dependentnej DNA polymerázy). Každý cyklus potom zdvojnásobí množstvo podľa štandardných protokolov PCR. RNA templátu môže byť celková RNA, mRNA alebo in vitro prepisované produkty RNA.
▆ Iv. Reverzná transkripcia v reálnom čase PCR (RT-QPCR)
Reverzná transkripcia PCR (RT-QPCR) v reálnom čase kombinuje techniky RT-PCR a QPCR, aby sa kvantitatívne analyzovala molekuly RNA. RT-QPCR sa široko používa v štúdiách úrovne expresie RNA, ako je analýza génovej expresie a detekcia vírusovej záťaže.
